Colorante

Colorantes y coloraciones Colorantes

Colorantes Los colorantes son sustancias de origen químico o biológico, generalmente tintes, pigmentos, reactivos u otros compuestos, empleados en la coloración de tejidos microorganismos para exámenes microscópicos, debiendo tener al menos, un grupo cromóforo que le proporcione la propiedad de teñir.

Fuente de obtención de los colorantes.

Atendiendo a la fuente de obtención, los colorantes se clasifican en naturales y sintéticos.

Colorantes naturales. Los colorantes naturales son básicamente histológicos, encontrándose entre los empleados con mayor frecuencia, los siguientes:

• Índigo: Se obtiene de diversas especie de plantas del genero indigófera que contiene indican, el cual se fermenta para producir el colorante.
• Carmín: Se produce, mediante el tratamiento con alumbre y otras sales metálicas a hembras del insecto cochinilla "Coccus castis".
• Orceína y Tornasol: Se obtiene mediante el procesamiento industrial de líquenes de los géneros: Le canora tinctoria y Rosella tinctoria.
• Hematoxilina: Este colorante se extrae con éter de la madera de un árbol oriundo de México y de algunos paises suramericanos denominados Hematoxilium campechianum.

Colorantes sintéticos. Se obtiene de la anilina, o es mas exactamente del alquitrán de hulla siendo todos derivados del benceno.

Clasificación

Los colorantes se clasifican, teniendo en cuenta si la propiedad tintorial se encuentra en el anión o el catión de su estructura química. Sobre esta base se pueden dividir en tres grupos: básicos, ácidos y neutros.

• Colorantes básicos: La acción colorante está a cargo del catión, mientras que el anión no tiene esa propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul de metileno+.
• Colorante ácido: Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante esta a cargo del anión, mientras que el catión no tiene propiedad, por ejemplo: eosinato- de sodio+
• Colorantes neutros: Están formados simultáneamente por soluciones acuosas de colorantes ácido y básicos, donde el precipitado resultante, soluble exclusivamente en alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene la propiedad tintorial de sus componentes ácidos y básicos, por ejemplo: la giemsa.

Afinidades tintoriales.

En el proceso de la coloración, ocurre una combinación de reacciones físicas y químicas.

• Reacción física.

Ocurre un fenómeno de absorción similar al que tiene lugar en las materias porosas, considerando que el colorante penetra en los intersticios del cuerpo coloreable y se mantiene allí por la cohesión molecular.

• Reacción química

Las células microbianas son ricas en ácidos nucleicos que portan cargas negativas en formas de grupos fósfato combinándose como colorante básicos cargados positivamente. Los colorantes ácidos que tienen la acción colorante en el anión no tiñen la célula, empleándose como colorante de contraste para colorear su entrono, como por ejemplo: la tinta china o la eosina que no colorea al microorganismo, pero si el fondo del campo microscópico.

Toxicidad de los colorantes. Ventajas y Desventajas.

Los colorantes son sustancias tóxicas, por lo tanto el proceso de la tinción generalmente resulta letal para los microorganismos, provocando su inmovilización, lo cual puede significar una ventaja o desventaja para el investigador según sean los objetivos con la sustancia colorante. Veamos algunos Ejemplos:

1. Al ocasionar la muerte de los microorganismos sometidos al proceso de tinción se reducen las posibilidades de contaminación para el manipulador.
2. Los colorantes pueden ser tóxicos para el manipulador, algunos incluso han resultado cancerigenos por lo que ha habido la necesidad de retirarlos del mercado.
3. Algunos colorantes solo tienen afecto letal para determinadas especies o géneros bacterianos, siendo utilizados como constituyentes de medios de cultivo selectivo para impedir el desarrollo de microorganismos indeseables y favorecer el desarrollo de las especies que nos interesa estudiar. Por ejemplo: el verde de malaquita.
4. Otros se emplean como desinfectantes microbianos, mas que para teñir, con fines de microscopia, por sus propiedades bacterianas o bacteriostáticas.
5. Algunos tipos de colorantes son empleados no para teñir, sino como indicadores de pH, formando parte de la composición de los medios de cultivo para indicar los cambios de basicidad o acidez que se vayan produciendo en el medio como consecuencia de su actividad metabólica. Ejemplo: rojo fenol, azul de bromotimol, etc.

Métodos de coloración

Atendiendo a los objetivos que se persigan, los métodos de coloración se clasifican en: Tinción simple, tinción compuesta y tinción especial.

• Tinción simple: En la tinción simple se utiliza un solo colorante con el que se tiñe rápidamente el microorganismo, utilizándose fundamentalmente para observar su morfología y tamaño. Los colorantes empleados con mayor frecuencia para este tipo de tinción son los siguientes: azul de metileno, violeta cristal y fuscina fenicada, entre otros.
• Tinción compuesta: En este tipo de tinción, se utiliza más de una sustancia tintórea. Los colorantes se aplican, a la preparación, separados o juntos, formando parte de una solución. En consecuencia se puede determinar algunas características propias de diversos géneros que permiten diferenciarlo de los demás, por lo que reciben también el nombre de coloraciones diferenciales. Entre los métodos mas utilizados se encuentran: La coloración de Gram. y la de Ziehl Neelsen.

Coloración de Gram.

En 1884, el danés Hans Chistian Gram, ideó un método de coloración, que es en la actualidad, el más empleado en los laboratorios de bacteriología, mediante el cual, la bacteria sometida a esta tinción, en dependencia de la composición química de la especie, queda teñida de color violeta o de color rojo.

Principios. A pesar de que esta técnica de coloración se ha venido empleando desde hace más de un siglo, aún no se ha podido determinar con exactitud la base molecular de la reacción, existiendo controversias al respecto. El criterio mas generalizado es que la violeta y el lugol forman un complejo que reacciona con los componentes bioquimicos de la pared celular deshidratada, fijándose en esta. Teniendo en cuenta que la composición química de la pared, no es igual en todos los géneros, la reacción resultante será obviamente diferente, lo que da lugar, que mientras algunos géneros retienen firmemente el colorante al resultar el complejo impenetrable para el decolorante, en otros géneros la barrera que se produce es más permeable, lo que permite al solvente penetrar y extraer el complejo violeta-lugol, dejando a la bacteria nuevamente incolora.

Fundamento técnico En el primer paso de la coloración, cuando los microorganismos presentes en el frotis son expuestos a la acción colorante de la violeta de genciana, todos los géneros que se encuentran en el frotis se tiñen de color violeta. Al adicionar el lugol, no se produce ningún cambio de color, ya que el lugol no es un colorante, sino un mordiente, que se adiciona con el objetivo de formar un complejo violeta-lugol, para fijar el color en la bacteria. Al adicionar el decolorante (alcohol etilicio o alcohol acetona) algunos géneros no son afectados por estos solventes, reteniendo por consiguiente el color violeta aplicado inicialmente, en tanto que otros son decolorados quedando la bacteria nuevamente incolora. Al echar finalmente la solución de safranina (que es de color rojo ) las especies que no fueron decoloradas, mantienen la coloración violeta ya que la safrania es un colorante mas débil que la violeta y su adición no influye significativamente en cambio de color, en tanto que los géneros que fueron decolorados por el alcohol, se tiñen con la safrina, adquiriendo un color de 199.

Coloración de "Ziehl Neelsen.

Algunos géneros microbianos dentro de los que se incluyen las microbacterias, tienen la propiedad de retener el colorante con que han sido teñidas, aunque sean sometidos a la acción de solventes tan fuertes como los ácidos para su decoloración, el primer método de coloración para este tipo de microorganismo, fue concebido y aplicado por Robert Koch, descubridor del agente causal de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis o Bacilo de Koch. Fue modificada y perfeccionada posteriormente por Ziehl y Neelsen. Este método se utiliza hoy en dia, con alguna que otra modificación en función de las particularidades de la especie en estudio.

Principio Las microbacterias, como el Mycobaccterium tuberculosis y otras especies susceptible de ser coloreadas por esta técnica, se caracterizan por tener una alta proporción de ácido micolico (lípidos) en su pared celular. La acción del calor, introducido en este método, hace que la misma se permeabilice y haga accesible la penetración de la fucsina, tiñéndose la pared celular. Al normalizarse la temperatura de la preparación, el compuesto lipidico impermeabiliza la pared a la acción del decolorante ácido, con lo cual el microorganismo se mantiene teñido. El resto de las especies, así como las células epiteliales y otros artefactos, que no disponen de ácido micólico en su pared o membrana, son decolorados, después de teñidos por la fucsina.

Fundamento técnico Al someter el frotis a la acción de la Fucsina, todos los microorganismos, independientemente de que dispongan o no de ácido micolico en sus respectivas paredes celulares serán coloreados de rojo. Al aplicar el decolorante ácido, las especies que posean el ácido micolico en la pared, resisten la acción decolorante y se mantienen teñidas de rojo, en tanto que las demás se quedan incoloras. Al aplicar la coloración de contraste (azul de metileno) las bacterias que retuvieron el color proporcionado por la fuscina, no sufren ninguna alteración permaneciendo de color rojo, pero las especies que si fueron decoloradas, se tiñen de azul, al igual que las células epiteliales y otros artefactos presentes en la preparación.

Coloración Fragelar de Leifson (modicficación de Clark)

Los flagelos son estructuras, cuyo diámetro no excede de los 30mm, lo cual esta muy por debajo del poder de rersouciòn del micrososcopico optico. Para hacer visibles a los flagelos se requiere aumentar su grosor, para lo cual se emplea una suspensión de acido tanico que al precipitarse sobre su cubierta forman una capa que aumenta aparentemente su diámetro. Lo que propicia que al ser posteriormente coloreado, tanto los flagelos como su disposición con respecto al bacilo se hagan visibles al microscopista.

Coloración de cápsula.

La cápsula es una sustancia viscosa producida por algunas especies que la sintetizan a partir de polipéptidos, polímeros de glucosa u otros aminoazucares que contienen nitrógeno, que después de combinarse con el agua es segregada por todo el contorno de la pared celular como un moco gelatinoso. Cuando la cápsula ha sido producida puede observarse en los frotis coloreado por el método de Gram como un halo incoloro alrededor de la bacteria. Cuando se requiere ver la cápsula con más detalle o inducir su producción se recurre a coloraciones especiales.

Véase también

Colorante alimentario

Fuente

• José González Alfaro. Laboratorio de Microbiología: Instrumentación y principios básicos/ José González Alfaro, Boris González González, Rosa T. Barrial González. La Habana: Editorial Ciencias Médicas; 2004.