Cultivo de microorganismos

Cultivos de microorganismos Concepto: Es el crecimiento de poblaciones microbianas de forma controlada en un medioartificial.

Cultivos de microorganismos. Tienen un uso creciente en la Biotecnología y la protección medioambiental, por lo que es una necesidad de mantenerlos de manera que las propiedades que los hacen importantes permanezcan estables.

Cultivo microbiano

Un cultivo es el crecimiento de poblaciones microbianas de forma controlada en un medioartificial.

Medio de cultivo

Soporte que va a contener los nutrientes necesarios, así como unas condiciones óptimas de pH y humedad que permite el desarrollo y crecimiento de microorganismos.

Clasificación de los medios de cultivos

En función de su consistencia

• Sólidos: al medio de cultivo sólido se le añade un agente gelificante o solidificante. Se preparan en erlenmeyer, se dejan enfriar y luego se pueden pasar o bien a una placa o bien a un tubo.

Los gelificantes más habituales son:

• Agar Agar: es un alga que se caracteriza por ser inerte frente a los microorganismos y porque es líquido a la temperatura de ebullición y solidifica entre los 45-50ºC.
• Gelatina.
• Líquidos o caldos: contiene los nutrientes y, en lugar de añadir el agar, tienen el agua que se utiliza para diluir el medio de cultivo. Se preparan en tubo.
• Semisólidos: contienen agar (<5-10%). Se utilizan cuando queremos observar movilidad bacteriana. Se hace en tubo y se utiliza la siembra en picadura con asa recta.

En función de su composición

• Empíricos: son aquellos en los que no se conoce exactamente su composición. Ya no se utilizan en los Laboratorios.
• Químicamente definidos: se conoce exactamente la composición y la concentración de cada uno de los nutrientes que componen el medio de cultivo.
• Complejos o indefinidos: Contienen sustancias altamente nutritivas, pero de composición indefinida. Suelen llevar sustancias como extractos de carne, peptona, extractos de levadura, bovril... La ventaja de este medio de cultivo es que contiene muchos factores de crecimiento, por lo que podemos cultivar en él gran número de microorganismos. El inconveniente es que no conocemos lo que el microorganismo está consumiendo. Ejemplos:

Caldo nutritivo: extracto de carne + peptona + agua

Agar nutritivo: extracto de carne + peptona + agua + agar.

En función del uso que se le da

• Enriquecidos: son aquellos medios en los cuales a un medio base se le añaden determinadas sustancias nutritivas que son necesarias para el crecimiento de un microorganismo exigente.Ejemplo: agar-sangre.
• De enriquecimiento: se utilizan solamente cuando se sospecha que el microorganismo de la muestra se encuentra en un número muy pequeño. Se le aporta los nutrientes y se espera que crezcan de 6 a 8 horas. Esto se utiliza, por ejemplo, cuando se sospecha la contaminación en alimentos por Salmonella.
• Diferenciales: incorpora determinadas sustancias que nos permiten diferenciar entre dos tipos de microorganismos. Ej. El agar de sal y manitol: nos permite diferenciar en el caso de los staphylococos, los que utilizan el manitol en su metabolismo de los que no. Si lo utilizan originan ácidos, con lo que el pH disminuye y el indicador cambia de color.
• Selectivos: llevan incorporadas determinadas sustancias qqe inhiben el crecimiento de un microorganismo y facilita el crecimiento del microorganismo que nos interesa. Ej. Agar de sal y manitol: el NaCl (5%) inhibe el crecimiento de ciertos m.o y facilita el desarrollo de otros que crecen mejor en ese medio.
• Transporte y mantenimiento: se utilizan cuando la muestra no se puede procesar inmediatamente después de haberla tomado.

Condiciones de almacenamiento de los medios de cultivo

La mayoría de los medios de cultivo se encuentran deshidratados y éstos se deben conservar de la siguiente forma:

• Frescos, secos, sin luz solar y algunos en nevera (Ej. Salmonella).
• Aperturas y cierres los menos posibles para que los productos no capten humedad.

Cuando los medios son preparados tanto por empresas como por el propio Laboratorio, se deben almacenar teniendo en cuenta:

• La temperatura ha de estar entre 2-8ºC. Se conservarán entorno a 4-6 semanas.
• Si es necesario refundir, se hará al baño María o en autoclave 5 min.

Preparación de un medio de cultivo

Puesto que la mayoría de los medios de cultivo se encuentran deshidratados, para su preparación será necesaria la adición de agua destilada o desmineralizada con un pH próximo a 7. Para preparar el medio de cultivo se utiliza un erlenmeyer limpio y enjuagado con agua destilada o desmineralizada. El volumen del erlenmeyer deberá ser el doble del volumen de medio de cultivo que queramos preparar.

Pasos a realizar:

• Dependiendo del volumen de medio de cultivo que vayamos a preparar, pesar en un vidrio de reloj la cantidad necesaria del medio de cultivo deshidratado.
• Medir en una probeta la cantidad de agua destilada necesaria.
• Añadir parte del agua a un erlenmeyer adecuado al volumen que vamos a preparar.
• Añadir al erlenmeyer el medio de cultivo.
• Agitar hasta la disolución parcial y calentar un poco.
• Añadir el resto del agua que nos servirá para limpiar la superficie del objeto utilizado para pesar.
• Colocamos el erlenmeyer sobre el mechero, apoyado en una rejilla que permita la difusión del calor y calentamos durante un tiempo que vendrá determinado en el prospecto del producto.
• Por último debe pasar por el proceso de esterilización.

Todos los medios de cultivo se preparan en erlenmeyer, independientemente de si es sólido o líquido. Lo que diferencia su preparación es la forma de esterilizar:

• Medios de cultivo sólidos en placa: se preparan y esterilizan en el erlenmeyer. Para la esterilización se coloca un tapón de algodón envuelto en una gasa, tapado con papel y sellado con una cinta adhesiva.
• Medios de cultivo sólidos o líquidos en tubo: se preparan en el erlenmeyer y se esteriliza en el tubo. Los tubos se llenan con un volumen que oscila entre los 5-10 mL (utilizamos una pipeta), se tapan con un tapón metálico y cubiertos con papel y cinta adhesiva. Se esterilizan colocados en una gradilla, aunque para aumentar la superficie se suelen colocar de forma inclinada.

Crecimiento bacteriano

El crecimiento bacteriano necesita de una serie de sustancias y de ambientes que faciliten su desarrollo. Estas características pueden ser: FÍSICAS Temperatura: teniendo en cuenta la temperatura, podemos clasificar a los microorganismos en:

• Mesófilos: son capaces de desarrollarse a temperaturas que pueden oscilar entre los 20-45ºC. Temperatura óptima = 35-37ºC.
• Termófilos: son capaces de desarrollarse a temperaturas superiores a los 45ºC.
• Sicrófilos: son capaces de desarrollarse a temperaturas que oscilan entre 0-20ºC.

PH: el pH óptimo en el que se desarrollan la mayoría de los microorganismos es neutro, que oscila entre 6,5-7,5. Los m.o que se desarrollan a pH = 4 se denominan “acidófilos”. En ocasiones, como consecuencia del metabolismo bacteriano, se producen residuos que acidifican el medio. Para mantener el medio neutro se utilizan tampones. El más utilizado es el de sales fosfato, que además sirven de alimento a los microorganismos, Presión Osmótica: es la presión que se origina por difusión o intercambio de soluciones de diferente concentración a través de una membrana. La mayoría de los microorganismos habitan en medios hipotónicos. Su membrana debe ser selectivamente semipermeable para que se pueda dar ese fenómeno. QUÍMICAS Oxígeno O2: a pesar de ser un elemento fundamental para la mayoría de los organismos, es bastante tóxico y con efectos corrosivos.

Carbono: es un elemento que forma parte de la estructura básica de la materia viva. Las fuentes a partir de las cuales los m.o obtienen este elemento son:Las proteínas (en forma de peptonas. Sirve para diferenciar m.o, por ejemplo, cuando tenemos un medio de cultivo con lactosa y peptonas). Los hidratos de carbono (fundamentalmente la glucosa y la lactosa. Se usa cuando no nos importa el tipo de m.o que crezca en ese cultivo). Los lípidos.

Nitrógeno, Fósforo y Azufre:Nitrógeno: se necesitan fundamentalmente para la síntesis de proteínas, es decir, para formar el grupo amino de los aminoácidos, también se utiliza para crear el DNA y el RNA,. para sintetizar aminoácidos y vitaminas y para sintetizar ácidos nucleicos y fosfolípidos de las membranas nucleares.

Potasio, Magnesio, Calcio: Su función principal es que son necesarios como cofactores de las enzimas. Una enzima tiene una parte proteica (apoenzimas) y otra no proteica (cofactor). Esta última puede ser un ión metálico o una molécula orgánica compleja llamada coenzima. Los cofactores pueden dar o aceptar átomos requeridos por el sustrato.

Oligoelementos: Hierro, Cobre, Zinc,. Participan como cofactores de las enzimas.

Factores orgánicos de crecimiento: Compuestos orgánicos esenciales que el organismo es incapaz de sintetizar.

Cultivo de microorganismos aerobios estrictos

En placas petri sobre medios sólidos. La superficie del medio de cultivo está en contacto con el oxígeno atmosférico, luego no hay ningún problema para cultivar este tipo de microorganismos. En medio líquido, el microorganismo crece en la disolución, donde la concentración de oxígeno es menor, y disminuye en función del crecimiento del microorganismo. Para evitar esa disminución de oxígeno, utilizamos dos recursos:

• Agitación
• Adición de aire u O2 estéril mediante burbujeo.

Cultivo de microorganismos anaerobios estrictos

En medio líquido, añadimos al medio de cultivo agentes reductores que toman el O2 disuelto en el agua y forman H2o. Estos agentes son cisteína o tioglicolato, por ejemplo. Otra manera es bombeando CO2 o N2 libre de 02 al medio, mediante burbujeo. En medio sólido, se emplean jarras de anaerobiosis o jarras de Gas-Pak. Su tamaño es similar al de un termo. En su interior se colocan las placas petri invertidas. El recipiente se cierra con una tapa hermética. En la parte inferior hay un catalizador de paladio. Para conseguir la anaerobiosis, introducimos sobres de anaerobiosis, que contienen NaCO3 y borohidruro de sodio. Al añadir agua al sobre, se libera H2 y CO2. El oxígeno presente se reduce a agua. Para verificar la anaerobiosis hay un indicador, que consiste en una tira de papel impregnada con azul de metileno. En condiciones aeróbicas, la tira es azul, pero sino, es transparente. En la tapa hay un manómetro con el que medimos la presión interna, ya que se están desprendiendo CO2 y H2.

Conservación de los cultivos

La preservación de los cultivos microbianas no es tarea fácil y debe garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad genética de los cultivos, características que coinciden con los objetivos de un buen método de conservación. El conocimiento de las peculiaridades de las disímiles técnicas de preservación existentes para su correcta aplicación, así como el seguimiento continuo de las propiedades de las cepas, propician su empleo como inóculo confiable en la industria, la docencia y la investigación.

Con frecuencia la elección de la técnica más adecuada para conservar cultivos microbianos resulta difícil, pues deben tomarse en consideración los criterios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genéticos, número y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, así como la frecuencia del uso de los cultivos.

El método de conservación que se elija debe garantizar la supervivencia de al menos el 70 % de las células por un período considerable de tiempo, de forma tal que la población sobreviviente se asemeje a la original como sea posible, conserve las propiedades de importancia de los cultivos y minimice la ocurrencia de los eventos genéticos. De igual manera debe reducir al mínimo el riesgo de contaminación y permitir que la pureza del cultivo permanezca inalterable.

Variadas técnicas se encuentran disponibles para la conservación de microorganismos y para eso debe considerarse lo recomendado por la Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC, siglas en inglés), en sus guías generales, la cual enuncia que por seguridad y para minimizar la probabilidad de pérdida de las cepas, cada una debe ser mantenida por al menos 2 procedimientos diferentes. En general, existen 3 categorías en las que se agrupan los métodos de preservación según el tiempo en que permanecen viables las células conservadas, que son los métodos de conservación a largo, mediano y corto plazos.

Clasifican en la primera de estas categorías la congelación (a –70 °C y –196 °C) y la liofilización 1-4 como técnicas que minimizan al máximo el riesgo de cambio genético en las células y las mantienen viables por 10 años o más, ventajas que han condicionado su extensa utilización para conservar disímiles materiales biológicos (cultivos de hongos, bacterias y levaduras, algas, suero, células sanguíneas, entre otros) y que sean reconocidas como técnicas de elección. El elevado costo de los equipos que emplean estos métodos dificulta su implementación en muchas instituciones, las que en ocasiones hacen uso del servicio de mantenimiento y conservación mediante estos, los cuales brindan colecciones de cultivos reconocidas.

A mediano plazo, es el término que agrupa las técnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los cultivos entre 2 y 5 años. Se destacan en este grupo la desecación en diferentes soportes (arena, sílica gel, perlas de vidrio) donde la paralización del crecimiento se produce por eliminación del agua disponible,1-3,9) así como el almacenamiento en tierra, parafina líquida y la suspensión en agua estéril (destilada o de mar), métodos bien documentados en especial para los hongos.

La resiembra periódica es una técnica que permite la supervivencia de los cultivos en cortos períodos de tiempo, por eso se reconoce como un método de conservación a corto plazo.2,9 Se basa en transferir el cultivo del medio seco a uno fresco proporcionándole las condiciones óptimas de crecimiento, lo que condiciona el elevado riesgo de contaminación y variabilidad de las características de las cepas, las cuales constituyen sus principales desventajas.

Por último, es frecuente encontrar que una técnica de preservación resulte más efectiva para un grupo microbiano que para otro, lo que indica que además de considerar los aspectos anteriores es necesario revisar la literatura disponible sobre los microorganismos en cuestión y las alternativas de mantenimiento utilizadas, y adecuarlas a la situación real de la organización. Podemos entonces resaltar que no existe una técnica universal para conservar adecuadamente todos los microorganismos.

Fuentes

• Jorgensen- Hansen. Microbiología de las fermentaciones industriales. Editorial Acribia.
• Martín Viladón. Ingeniería de las fermentaciones. Folleto FT1294 I.S.P.J.A.E.
• Sasson, Albert. Las biotecnologías: desafíos y promesas Investigaciones Biológicas. La Habana. 1984